注意：冷凍保存的細(xì)胞非常脆弱。將小瓶置于37°C水浴融化細(xì)胞，然后盡快移入培養(yǎng)物(液)中，盡量減少操作。

準(zhǔn)備

1.準(zhǔn)備纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶(2 μg /cm2，推薦用T-75的培養(yǎng)瓶)。向培養(yǎng)瓶中加入10 ml無(wú)菌Dulbecco's磷酸鹽緩沖液（DPBS），然后加入150 μl 纖維連接蛋白原液(1 mg/ml, Sigma cat. no. F1141)。將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中孵育。

2.準(zhǔn)備*培養(yǎng)基：用70%的酒精消毒培養(yǎng)基和添加物的外表面，然后放到無(wú)菌的地方。在無(wú)菌環(huán)境下打開每一個(gè)添加物管并用吸管將其加入到基本培養(yǎng)基中。以保證添加物全部加入基本培養(yǎng)基中。

3.吸出纖維連接蛋白溶液并向瓶?jī)?nèi)加入20 ml*培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶放入超凈臺(tái)中，然后準(zhǔn)備融化細(xì)胞。纖維連接蛋白溶液可以使用兩次。

4.將小瓶放入37°C水浴中，握住并輕輕旋轉(zhuǎn)小瓶直到其內(nèi)細(xì)胞*融化。將小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精沖洗小瓶，然后放到無(wú)菌環(huán)境中。小心地打開蓋子，注意手指不要碰到里面的螺紋。eppendorf吸管輕輕重懸管內(nèi)容物。

5.將管內(nèi)容物均勻的放入纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中。推薦的接種密度為7,500 cells/cm2。

注意：不推薦在細(xì)胞融化后進(jìn)行稀釋和離心，因?yàn)檫@些操作比培養(yǎng)基中的DMSO殘留物對(duì)細(xì)胞的傷害更大。需要注意的是，內(nèi)皮細(xì)胞接種在纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中能夠促進(jìn)細(xì)胞的帖壁。

6.蓋好培養(yǎng)瓶的蓋子，輕輕地?fù)u動(dòng)培養(yǎng)瓶以使細(xì)胞分布均勻，如需氣體交換則適當(dāng)放松瓶蓋。

7.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中。

8.為了得到良好的結(jié)果，在培養(yǎng)開始后至少16個(gè)小時(shí)內(nèi)不要?jiǎng)优囵B(yǎng)物。第二天更換培養(yǎng)基以去除殘留的DMSO和未貼壁的細(xì)胞，然后每隔一天進(jìn)行如上操作。培養(yǎng)良好的細(xì)胞將呈現(xiàn)鵝卵石形或紡錘體形，細(xì)胞質(zhì)無(wú)顆粒且細(xì)胞數(shù)量在培養(yǎng)2-3天后會(huì)倍增。[2] 

培養(yǎng)的維持

1.應(yīng)用冰凍的細(xì)胞構(gòu)建培養(yǎng)物后，可于次日早晨更換新鮮的含有添加物的培養(yǎng)基。隨后的傳代培養(yǎng)中，每隔48小時(shí)更換一次培養(yǎng)基。

2.此后每隔一天更換一次培養(yǎng)基，直到細(xì)胞約達(dá)到50%融合。

3.一旦細(xì)胞達(dá)到50%融合，則要每天更換培養(yǎng)基直到細(xì)胞大約達(dá)到90%融合。

傳代培養(yǎng)：

1.細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.傳代培養(yǎng)的前一天準(zhǔn)備纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶(2 μg/cm2)。

3.將培養(yǎng)基，胰酶/EDTA消化液，胰酶中和液和DPBS(磷酸鹽緩沖液) 加熱至室溫。我們不推薦在使用前用37°C水浴加熱試劑和培養(yǎng)基。

4.用DPBS沖洗細(xì)胞。

5.用10 ml胰酶/EDTA消化液消化細(xì)胞(以T-75培養(yǎng)瓶為例)，直到80%細(xì)胞呈現(xiàn)圓形(在顯微鏡下觀察)。立刻加入10 ml 胰酶中和液并輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。

注意：應(yīng)用ScienCell研究室的胰酶/EDTA消化液能使由于過度消化導(dǎo)致的細(xì)胞死亡降到zui小程度。

6.收取細(xì)胞并將其移入50ml離心管中。另外用10ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)瓶以收集殘留的細(xì)胞。在顯微鏡下觀察剩余細(xì)胞數(shù)量以確定是否收集成功。剩余細(xì)胞數(shù)應(yīng)小于5%。

7.以1000轉(zhuǎn)/分（1000rpm）離心收取的細(xì)胞懸液5分鐘，然后在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。

8. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，然后將它們以推薦的細(xì)胞密度接種在新的纖維連接蛋白包被過的培養(yǎng)瓶中

注意：

處理人類來(lái)源的產(chǎn)品存在潛在的生物風(fēng)險(xiǎn)。盡管每一株細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)為艾滋病病毒，乙肝病毒，丙肝病毒陰性，但檢測(cè)并不能達(dá)到100%準(zhǔn)確，因此，必須采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施以避免無(wú)意中的暴露。操作這些產(chǎn)品時(shí)請(qǐng)帶手套和安全鏡。不要用嘴吸。我們推薦采用通用的程序來(lái)處理人源性產(chǎn)品，從而達(dá)到以zui小的預(yù)防來(lái)對(duì)抗污染。